Glerjun var ekki ein uppfinning. Hún varð til þegar vísindamenn leystu röð ólíkra vandamála í frumum, fósturvísum, líffærum og að lokum í lífstöðvun manna.
Markmiðið hljómar einfalt: að kæla vatnsríkan vef í gler án þess að skaðlegur ís myndist.
Framkvæmdin er ekki einföld. Frostvarnarefni geta verið eitruð. Innleiðing þeirra getur aflagað frumur. Stórir hlutir kólna ójafnt, safna spennu og eru mun erfiðari í upphitun.
Nútímaaðferðir eru því kerfi, ekki uppskriftir. Gæði þeirra ráðast af því að efnafræði, flæði, hitastig, tímasetning, lögun og mælingar vinni saman.
Fyrir glerjun: kuldinn skapaði annan skaða
Snemma snerist frostvarðveisla að mestu um frystingu. Kæling hægði á efnaferlum, en vatnið kristallaðist í ís.
Ís ýtir söltum og öðrum uppleystum efnum út í vökvann sem eftir er. Frumur geta því samtímis orðið fyrir vélrænni tilfærslu, öfgakenndum styrk uppleystra efna, ofþornun og himnuskaða.
Hraðari kæling getur gert kristallana smærri, en venjulegt vatn þarf óvenju mikinn hraða til að verða að gleri án efnafræðilegrar aðstoðar. Það gengur aðeins fyrir afar þunn sýni.
Sögulega vandamálið var ekki aðeins að ná lágu hitastigi. Það var að ná því án þess að leyfa vatninu að raðast upp í skaðlega kristalla.
1937 til 1938: fyrstu hreyfifræðilegu glerjunartilraunirnar
Basile Luyet lagði glerjun til sem aðferð við líffræðilega varðveislu árið 1937.
Árið 1938 greindu Luyet og Eugene Hodapp frá endurheimt hreyfigetu í sæði froska sem sett var í fljótandi loft eftir vatnstap með þéttri súkrósalausn.
Upphaflega tilraunin byggðist á smásæjum filmum og öfgakenndum kælihraða. Hún sýndi fram á eðlisfræðilegan möguleika, ekki verklag fyrir líffæri sem hægt væri að stækka.
Þessi nálgun er nú kölluð hreyfifræðileg glerjun: að vera fljótari en kristöllunin með því að fjarlægja varma hraðar en ís nær að myndast og vaxa.
Stærðin vinnur á henni. Yfirborð vex hægar en rúmmál, svo miðja stórs sýnis getur ekki fylgt yfirborðinu nógu hratt.
1949: glýseról breytir vandamálinu
Christopher Polge, Audrey Smith og Alan Parkes uppgötvuðu árið 1949 að glýseról gæti varið sáðfrumur við varðveislu í lágu hitastigi.
Skýrsla þeirra í Nature staðfesti hagnýtt mikilvægi frostvarnarefna sem komast inn í frumur.
Þessar sameindir fara inn í frumur, binda vatn og draga úr því ísmagni sem myndast við tiltekið hitastig. Þær draga einnig úr skaðlegum styrk uppleystra efna við frystingu.
Uppgötvunin umbreytti frostlíffræði því kælihraði var ekki lengur eina stýribreytan. Efnasamsetning gat mótað fasahegðun vatns.
Hún fól einnig í sér nýtt bestunarvandamál. Meira frostvarnarefni bælir ís betur, en eykur efnafræðilegan og osmótískan skaða.
1959 til 1968: fleiri efni og þrepaskipt innleiðing
Árið 1959 greindu James Lovelock og Marcus Bishop frá því að dímetýlsúlfoxíð verndaði nokkrar frumugerðir gegn frystiskaða.
DMSO fór í gegnum sumar himnur auðveldar en glýseról. Það stækkaði hóp þeirra frumna sem hægt var að verja og er enn víða notað í rannsóknastofu- og klínískri frostvarðveislu.
John Farrant kannaði svo að auka styrk frostvarnarefnis um leið og hitastig var lækkað, og halda vefnum í þéttri lausn án þess að mynda ís af ásetningi.
Þetta boðaði kjarnaeinkenni nútímaverklags: frostvarnarefni er innleitt í þrepum, við lágt hitastig, í stað þess að útsetja hlýjan vef fyrir fullum styrk í einu.
Þrepaskipt innleiðing takmarkar osmótískt álag. Lægra hitastig hægir á mörgum efnahvörfum og getur gert annars skaðlega útsetningu bærilegri.
Árið 1968 sýndu tilraunir að rauð blóðkorn gætu náð hitastigi fljótandi köfnunarefnis án sýnilegs íss við nægilega háan styrk glýseróls.
Hugmyndalegu hlutarnir voru til staðar. Það sem vantaði var hagnýt leið til að beita þeim á flókinn vef með æðakerfi.
1984: glerjun verður aðferð fyrir líffæri
Greinin frá 1984, “Vitrification as an Approach to Cryopreservation”, setti glerjun fram sem alvarlega leið að líffærabönkum.
Aðferðin var stundum kölluð jafnvægisglerjun. Í stað þess að krefjast ómögulegs kælihraða skal nota nægilegt frostvarnarefni til að hinn afgerandi kælihraði verði viðráðanlegur í stærra kerfi.
Þessi breyting afhjúpaði þrjár samtengdar takmarkanir:
- Lausnin verður að standast ís við þann kæli- og upphitunarhraða sem næst.
- Líffærið verður að þola innleiðingu og fjarlægingu þeirrar lausnar.
- Frostvarnarefnið verður að ná til hvers svæðis áður en kæling hefst.
Blanda gat virkað afburðavel í tilraunaglasi en brugðist í líffæri af því að æðamótstaða, dreifingarvegalengd eða eituráhrif breyttu niðurstöðunni.
1985: lifandi fósturvísar snúa aftur úr glerkenndu ástandi
William Rall og Gregory Fahy greindu frá íslausri frostvarðveislu músafósturvísa við -196°C árið 1985.
Þetta var afgerandi líffræðileg sönnun. Lifandi spendýrafrumur með kjarna gátu lifað af kælingu og upphitun í gegnum algerlega glerjað ástand.
Fósturvísar eru samt örsmáir. Hitastig þeirra og styrkur geta breyst hratt og jafnt samanborið við líffæri í fullorðnum.
Niðurstaðan staðfesti aðferðina en gerði stærðarvandann um leið sýnilegri.
Stærðarvandinn skiptist í fjögur vandamál
1. Eituráhrif frostvarnarefna
Sá styrkur sem þarf til glerjunar getur raskað prótínum, himnum og efnaskiptum frumna. Eituráhrifin ráðast af efninu, styrknum, hitastiginu, lengd útsetningar og vefjagerð.
Það þýðir að “minna eitrað” er ekki eiginleiki einnar sameindar. Það er eiginleiki alls verklagsins við innleiðingu og fjarlægingu.
2. Osmótískt álag
Þétt lausn dregur vatn út úr frumum. Að fjarlægja hana getur ýtt vatninu of hratt aftur inn.
Nútímaverklag notar stigvaxandi styrk, burðarlausnir, hitastýringu og uppleyst efni sem komast ekki inn í frumur til að halda rúmmálsbreytingum innan þolmarka.
3. Ójöfn dreifing
Líffæri er ekki ílát með einsleitum vökva. Frostvarnarefni ferðast um æðar, fer gegnum veggi háræða og dreifist um vefinn.
Blóðsegar, bjúgur, æðasjúkdómar, blóðþurrð og blóð-heila þröskuldurinn geta skilið sum svæði eftir undir þeim styrk sem þarf til að bæla ís.
Þess vegna mælir nútíma flæðismeðferð þrýsting, flæði, hitastig og styrk í bláæðum í stað þess að treysta eingöngu á rúmmál lausnarinnar.
4. Varmastigull
Stór hlutur kólnar utan frá og inn. Ólíkt hitastig veldur ólíkum samdráttarhraða.
Nálægt glerjunarmörkunum og neðan þeirra getur efnið ekki losað spennu hratt. Ef spennan fer fram úr vélrænum styrk þess geta sprungur myndast.
Lausnin var kæling með stýrðum hraða, mýking nálægt Tg og hægari lækkun gegnum glerkennda svæðið. Þessi lögmál móta nú tölvustýrða kælingu manna.
1990-áratugurinn og 2000-áratugurinn: blöndur leysa af hólmi hugsun um eitt efni
Ekkert eitt frostvarnarefni uppfyllti allar kröfur best. Vísindamenn blönduðu í vaxandi mæli saman efnum sem komast inn í frumur svo hvert gæti lagt sitt af mörkum án þess að ná sínum versta styrk.
Burðarlausnir stýrðu jónum, sýrustigi og osmótískum aðstæðum. Fjölliður sem komast ekki inn í frumur höfðu áhrif á vatn í vef og hegðun æða.
Tilbúnir ísteppar beindust að ómsleitri ísmyndun og ísvexti. Þeir drógu úr því að treysta eingöngu á háan styrk frostvarnarefnis.
Lausnir eins og VS55 og síðar M22 voru kerfishönnun: mörg efni, ísteppar og vandlega hönnuð burðarefnafræði ásamt skilgreindu verklagi um flæði og varma.
Yfirlitsgrein um glerjun líffæra frá 2004 lýsir framförum í að draga úr eituráhrifum, í kæliskaða, stjórn á ískímum og flæðismeðferð líffæra.
Mikilvæga framförin var ekki sú að eituráhrifin hyrfu. Vísindamenn lærðu að dreifa álaginu á efnafræði, tíma og hitastig.
Tilraunir á kanínunýrum: mikilvægar og auðvelt að ofmeta
Vinna með kanínunýru sýndi að hægt væri að fylla spendýralíffæri með æðakerfi af flókinni glerjunarlausn, kæla það í glerkennt ástand, hita það aftur og græða það í.
Eitt nýra sem greint var frá hélt kanínu gangandi sem eina starfandi nýra hennar um lengri tíma.
Sú niðurstaða skiptir máli því hún fór frá smásæjum sýnum yfir í starfsemi líffæris. Hún kom ekki á áreiðanlegu klínísku verklagi.
Síðari fræðirit benda á að langtímaárangur ígræðslu hafi ekki náðst með endurtakanlegum hætti. Dreifing, eituráhrif og hefðbundin upphitun frá yfirborði voru áfram takmarkandi.
Þetta er rétt þekkingarleg staða: mikilvæg sönnun á lögmáli með vanda varðandi endurtekningu og stærð.
2015: gæði varðveislu verða sýnileg á kvarða taugamóta
Frostvarðveisla stöðguð með aldehýði sameinaði efnafestingu, flæði frostvarnarefnis og glerjun í heilum kanína og svína.
Rannsóknin frá 2015 greindi frá skýrum himnum, taugamótum, blöðrum, mýli og innanfrumubyggingum eftir upphitun og undirbúning fyrir rafeindasmásjá.
Hún sýndi að framúrskarandi fínbygging taugavefs gæti lifað af íslausa geymsluferð í stórum heilum.
Hún sýndi ekki endurheimt lífvænleika. Aldehýðfesting kross-tengir líffræðilegt efni af ásetningi og samrýmist ekki venjulegri endurheimt lifandi starfsemi.
Tilraunin svaraði því byggingarlegri spurningu, ekki spurningunni um endurlífgun í heild.
Víðtækara framlag hennar var aðferðafræðilegt: meta á varðveislu með því að skoða þær byggingar sem máli skipta, ekki aðeins með því að sjá að sýni virðist glerkennt.
2023: nanóupphitun leysir upphitun í nýrum rotta
Kæling er aðeins helmingur afturkræfrar frostvarðveislu. Upphitun er oft erfiðari.
Ef upphitun er of hæg getur ís vaxið við afglerjun. Ef varminn berst aðallega frá yfirborðinu geta varmastiglar sprengt líffærið.
Nanóupphitun tekur á báðum vandamálum með því að dreifa járnoxíðnanóögnum um æðakerfið og hita þær með riðstraums útvarpsbylgjusegulsviði.
Endurheimtu nýrun komu á lífsnauðsynlegri nýrnastarfsemi í þegum án eigin nýrna á því eftirfylgnitímabili sem greint var frá.
Árangurinn byggðist á meiru en upphituninni. Hópurinn skipti yfir í minna eitraða blöndu og reiknilíkanaði innleiðingu frostvarnarefnis til að bæta styrk í vefnum.
Þetta er endurtekinn lærdómur í sögu glerjunar: að leysa einn flöskuháls afhjúpar þann næsta, og árangursrík endurheimt krefst allrar keðjunnar.
2024 til 2026: stærri eðlisfræðileg kerfi og starfhæfur taugavefur
Árið 2024 greindu vísindamenn frá eðlisfræðilegri glerjun á kvarða mannslíffæris í kerfum af stærðinni 0.5 til 3 lítrar.
Þeir sameinuðu innri hitamælingar, mýkingu, stýrða kælingu og skoðun með ör-sneiðmyndatöku. Þeir sýndu einnig nanóupphitun í rúmmáli allt að 2 lítrum.
Stærstu tilraunirnar voru fyrst og fremst eðlisfræðilegar. Að forðast sýnilegan ís og sprungur er nauðsynlegt, en það staðfestir ekki líffræðilega endurheimt líffæris á stærð við mannslíffæri.
Árið 2026 greindi rannsókn í PNAS frá skammtíma endurheimt starfsemi í drekavef fullorðinna músa eftir glerjun og upphitun.
Rannsóknin mældi útlit vefsins, svörun hvatbera, örvanleika taugafrumna, boðflutning um taugamót og langtímastyrkingu.
Hún náði til heilasneiða úr músum og heilaheilasýna með lítilli heimtu, ekki til mannsheila. Þýðing hennar er þrengri og samt umtalsverð.
Hún sýndi að taugavefur fullorðinna spendýra getur endurheimt rafeðlisfræðilega starfsemi eftir að hreyfing sameinda hefur stöðvast í glerkenndu ástandi.
Lífstöðvun manna erfir vísindin við erfiðari aðstæður
Tilraunir með líffærabanka hefjast með heilbrigðum vef, stýrðri tímasetningu og skipulögðum aðgangi að æðakerfinu.
Lífstöðvun manna hefst eftir lagalegan dauða. Sjúkdómur, hlý blóðþurrð, blóðstorknun, bjúgur, flutningur og æðasjúkdómar geta öll skert dreifingu frostvarnarefnis.
Næsta markmið er byggingarleg varðveisla fyrir mögulega viðgerð í framtíðinni, ekki afturkræf ígræðsla í dag.
Þessi munur er ástæða þess að ekki má færa fullyrðingar úr rannsóknastofu beint yfir í fullyrðingar um sjúklinga.
Hvernig Tomorrow.bio aðlagaði glerjun að aðstæðum á vettvangi
Tomorrow.bio flutti frostverndandi flæðismeðferð fyrir allan líkamann í sérútbúna sjúkrabíla. Aðgerðin getur hafist nálægt sjúklingnum í stað þess að bíða eftir flutningi til Sviss.
Þetta breytir mikilvægum þætti sem efnafræðin getur ekki lagfært: hversu mikil blóðþurrðin er áður en flæðismeðferð hefst.
Núverandi verklag notar lausnarefnafræði byggða á VM-1, aðlagaða að frostvernd á vettvangi og flutningi með þurrís í kjölfarið.
Rannsóknaáætlun EBF hefur prófað VM-1 við hermdar aðstæður eftir dauða, þar á meðal þrjár klukkustundir af hlýrri blóðþurrð.
Áætlunin mældi ljósbrotsstuðul í bláæðum, tíma flæðismeðferðar, þyngdarbreytingu, rýrnun heila og ísmyndun um leið og breytingar á flæðilausn og verklagi voru prófaðar.
Þetta er hin hagnýta framlína í tilfellum manna: ekki hvort kjörlausn geti glerjast, heldur hversu vel hægt er að flæða um raunverulegan sjúkling með blóðþurrð.
Mælingar urðu hluti af verklaginu
Fyrri rannsóknir á glerjun staðfestu árangur oft með gagnsæi, varmamælingum, röntgengreiningu, lifun eða starfsemi eftir upphitun.
Lífstöðvun manna getur ekki notað endurheimt sem endapunkt í dag. Hún þarf því mælingar á gæðum varðveislu sem eru án skemmda eða byggðar á sýnum.
Tomorrow.bio sneiðmyndar hvern sjúkling við sama hitastig fljótandi köfnunarefnis til að meta dreifingu frostvarnarefnis og greina ís eða sýnilega galla við staðlaðar aðstæður.
Með sérstöku samþykki geta örsýni úr taugavef stutt mat með rafeindasmásjá á himnum, taugamótum og staðbundinni fínbyggingu.
Þessum aðferðum og takmörkunum þeirra er lýst í verklagi við gæðaeftirlit í lífstöðvun.
Mælingar breyta þróuninni sjálfri. Þegar bilun verður sýnileg og samanburðarhæf milli tilfella geta breytingar á efnafræði og verklagi beinst að henni.
Hvað hefur batnað og hvað er óleyst
Nútímaglerjun hefur náð nokkru sem fyrri frysting gat ekki:
- Íslausri varðveislu margra frumna, fósturvísa og smárra vefja.
- Endurheimt starfsemi glerjaðra líffæra úr dýrum í skilgreindum tilraunum.
- Byggingarlegri varðveislu á kvarða taugamóta í festum spendýraheilum.
- Tölvustýrðri kælingu og mýkingu stærri kerfa.
- Rúmmálsupphitun með tækni á borð við nanóupphitun.
- Aðferðum með sneiðmyndatöku og rafeindasmásjá til að mæla raunveruleg gæði varðveislu.
Hún hefur ekki skilað afturkræfri frostvarðveislu alls mannslíkamans.
Meðal þeirra vandamála sem eftir standa eru blóðþurrð eftir dauða, ójöfn flæðismeðferð, eituráhrif frostvarnarefna, áhrif á blóð-heila þröskuldinn, varmastiglar um allan líkamann, forðun sprungna og örugg og jöfn upphitun.
Jafnvel árangursrík byggingarleg varðveisla myndi skilja eftir framtíðarvandamál viðgerðar, endurlífgunar og meðferðar á upphaflegri dánarorsök.
Þessi aðgreining er útfærð í tæknilegum áskorunum afturkræfrar frostvarðveislu.
TL;DR: Glerjun batnaði með betri frostvarnarefnum, flæðismeðferð, stjórn á ísmyndun, kælingu, upphitun og mælingu á byggingu. Sum vandamál eru leyst á smáum kvarða, en afturkræfni fyrir allan mannslíkamann er enn óleyst.
Skoðaðu þetta hagnýta tól
Notaðu gagnvirka tólið til að kanna spurninguna í þessari grein.
Hleð gagnvirka tólið...
Frekari lesning